一、限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA消化的方案
1.限制性內(nèi)切酶反應(yīng)在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。
2. 20μl體積反應(yīng)體系如下：
DNA 0.2-1 μg
10×酶切buffer 2.0 μl
限制性內(nèi)切酶 1-2 u(單位)
加ddH2O 至 20 μl
限制性內(nèi)切酶zui后加入，輕輕混勻，稍加離心，放置于zui適溫度水浴并按所需的時(shí)間溫育，一般為37℃水浴消化3hr。
3.用于回收酶切片段時(shí)，反應(yīng)總體積可達(dá)50-200μl，各反應(yīng)組分需相應(yīng)增加。
4.多種酶消化時(shí)若緩沖液條件相同，可同時(shí)加入;否則，先做低溫或低鹽的酶消化，再做高溫或高鹽的酶消化。
5.酶切結(jié)束時(shí)，加入0.5M EDTA(pH 8.0)使終濃度達(dá)10mM，以終止反應(yīng)?；?qū)⒎磻?yīng)管在65℃水浴放置10min以滅活限制性內(nèi)切酶活性。
6.如消化反應(yīng)體積過大，電泳時(shí)加樣孔盛不下，可加以濃縮：終止反應(yīng)后，加入0.6體積的5M乙酸銨(或1/10體積3M NaAc)和2倍體積無水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃離心12000g× 5min。傾去含大部分蛋白質(zhì)的上清液。于室溫晾干DNA沉淀后溶于適量TE中(pH 7.6)。
7.如要純化消化后的DNA，可用等體積酚/氯仿(1∶1)和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。
二、電泳檢測
取質(zhì)粒酶切產(chǎn)物適量，加適當(dāng)loading buffer混勻上樣，以未經(jīng)酶切的質(zhì)?；?和酶切的空載體(如有)作對(duì)照，采用 1-5V/cm的電壓，使DNA分子從負(fù)極向正極移動(dòng)，至合適位置取出置紫外燈下檢測，攝片。
三、注意事項(xiàng)
1. 濃縮的限制性內(nèi)切酶可在使用前以1×限制酶緩沖液稀釋，切勿用水稀釋以免酶變性。
2. 購買的限制性內(nèi)切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是穩(wěn)定的。進(jìn)行酶切消化時(shí)，將除酶以外的所有反應(yīng)成分加入后即混勻，再從-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶時(shí)都應(yīng)更換一個(gè)無菌吸頭，以免酶被污染。加酶的操作盡可能快，用完后立即將酶放回-20℃冰箱。
3.盡量減少反應(yīng)體積，但要確保酶體積不超過反應(yīng)總體積的10%，否則酶活性將受到甘油的抑制。
4.通常延長時(shí)間可使所需的酶量減少，在切割大量DNA時(shí)可用。在消化過程中可取少量反應(yīng)液進(jìn)行微量凝膠電泳以檢測消化進(jìn)程。
5.注意星號(hào)酶切活力。
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