近日，BioTechniques的記者講述了研究人員如何借助新一代測(cè)序技術(shù)，來加速他們的人類互作組（interactome）研究。
1993年，系統(tǒng)生物學(xué)家Marc Vidal開始醞釀，繪制出活細(xì)胞內(nèi)每個(gè)蛋白之間的所有相互作用。那時(shí)大部分科學(xué)家正沉浸在基因測(cè)序的喜悅之中，但Vidal對(duì)蛋白更感興趣。他想，如果所有基因都測(cè)序完成，那么下一個(gè)合理的目標(biāo)將是繪制出所謂的蛋白互作組。
然而，這并非一件簡單的工作。那時(shí)，酵母雙雜交篩選只有四年，且實(shí)驗(yàn)很耗時(shí)。關(guān)于蛋白相互作用的測(cè)定，還沒有高通量的方法。但隨著測(cè)序的費(fèi)用開始下降，Vidal開始覺得潮流變了。
如今，Vidal及其他人已經(jīng)繪制了超過20%的人類互作組?；プ鹘M學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家們已經(jīng)開發(fā)出一些方法，優(yōu)化酵母雙雜交篩選和新一代測(cè)序。但這是一個(gè)很小的領(lǐng)域，他們的結(jié)果受限于高的假陰性和假陽性。因此，他們?cè)诓粩嚅_發(fā)新技術(shù)和新的計(jì)算方法，以協(xié)助他們的研究。
當(dāng)科學(xué)家在測(cè)序人類基因組時(shí)，他們明確知道他們?cè)谧鍪裁??；蚪M是線性的，您可以準(zhǔn)確找到起點(diǎn)和終點(diǎn)。對(duì)于互作組，就沒那么簡單了。人類細(xì)胞至少編碼了20,000個(gè)蛋白，而每個(gè)蛋白都有可能與其他任一蛋白相互作用。這樣就有2億對(duì)蛋白要檢驗(yàn)。
Stitch-seq技術(shù)
在經(jīng)典的酵母雙雜交研究中，目的蛋白（誘餌）融合在酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合域（DBD），它與報(bào)告基因的上游結(jié)合。GAL4的轉(zhuǎn)錄激活域（AD）與文庫中的每個(gè)蛋白（獵物）融合，以檢測(cè)它們與誘餌蛋白的可能相互作用。隨后每個(gè)獵物-AD融合蛋白與誘餌-DBD融合蛋白共表達(dá)。如果獵物蛋白與誘餌蛋白結(jié)合，那么GAL4轉(zhuǎn)錄因子將會(huì)重建，導(dǎo)致報(bào)告基因的表達(dá)。利用這種方法，一個(gè)基因的所有結(jié)合伴侶都可以鑒定出。
酵母雙雜交的高通量版本則加快了蛋白間相互作用的鑒定步伐，但受限于需要Sanger測(cè)序來確定互作伴侶。新一代測(cè)序（NGS）將大大加速此過程，但考慮到所有互作伴侶的PCR擴(kuò)增子的合并將消除每一對(duì)之間的特異關(guān)聯(lián)，這不太適用。去年，Vidal開發(fā)出一種名為Stitch-seq的方法，將NGS應(yīng)用在酵母雙雜交篩選中。
Stitch-seq的關(guān)鍵步驟在于PCR拼接（PCR stitching），這種PCR方法將每個(gè)相互作用伴侶的兩個(gè)序列連接成單個(gè)PCR擴(kuò)增子，之后再進(jìn)行合并。Vidal表示：“這種方法的魅力在于我們拼接的方式，我們?cè)趦蓚€(gè)片段之間引入了一段已知核苷酸。它是*自動(dòng)的。”DNA序列的拼接確保了相互作用伴侶對(duì)在新一代測(cè)序時(shí)的關(guān)聯(lián)。
他們的策略使整體費(fèi)用降低了近40%，并允許通量增加。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的不斷改善，測(cè)序費(fèi)用會(huì)持續(xù)下降。他們?cè)谘芯恐羞x擇了454 GS FLX測(cè)序平臺(tái)。之所以選擇這個(gè)平臺(tái)，是因?yàn)?54技術(shù)是新一代測(cè)序中讀長zui長的，而82 bp的接頭長度要求平均讀長要超過100 bp，才能可靠鑒定相互作用序列標(biāo)簽。
然而，Stitch-seq的缺點(diǎn)在于它仍然依賴酵母雙雜交。韋恩州立大學(xué)醫(yī)學(xué)院的生物學(xué)家Russ Finley談道：“我對(duì)這種技術(shù)又愛又恨。”酵母雙雜交常常伴隨著假陽性和假陰性。“你會(huì)得到很大的圖譜，包括數(shù)千個(gè)相互作用，其中一些是好的，也有很多垃圾，還有一些漏掉了。”
因此，F(xiàn)inley和他的同事轉(zhuǎn)向新的計(jì)算方法來分類雙雜交數(shù)據(jù)，同時(shí)他們也在等待加速數(shù)據(jù)采集過程的技術(shù)。現(xiàn)在的問題在于，還沒有技術(shù)來驗(yàn)證酵母雙雜交的數(shù)據(jù)，甚至充分了解漏掉了什么。
但科學(xué)家們能依賴他們了解的：蛋白表達(dá)和功能的數(shù)據(jù)。如果兩個(gè)蛋白從未或很少在同一組織或同時(shí)表達(dá)，那么很可能不會(huì)發(fā)生相互作用。類似地，如果已知兩個(gè)蛋白的功能迥異，那么它們也不大會(huì)相互作用。諸如此類的數(shù)據(jù)可用于評(píng)估酵母雙雜交數(shù)據(jù)中相互作用的可能性。此外，F(xiàn)inley的小組提出一種方法，綜合不同的數(shù)據(jù)集，以此為基礎(chǔ)為相互作用數(shù)據(jù)一個(gè)置信值。如果不同實(shí)驗(yàn)室利用不同方法都證明了相互作用，那么其置信值更高。
互作組生物學(xué)
一旦人類互作組繪制出，下一個(gè)問題是它將有什么用。與人類基因組相似，一旦圖譜完成，以及出現(xiàn)新技術(shù)來采集和分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)的力量才有可能變得更清晰。不過，科學(xué)家已經(jīng)顯示了互作組數(shù)據(jù)在研究細(xì)胞生物學(xué)和疾病狀態(tài)上的作用。
去年，馬普研究院分子遺傳學(xué)研究所的Ulrich Szl及其同事發(fā)表了超過500萬對(duì)蛋白的分析，并預(yù)測(cè)了94,000多個(gè)新的相互作用。為了*時(shí)間發(fā)現(xiàn)蛋白對(duì)，他們并沒有依賴培養(yǎng)皿中的酵母雙雜交，而是利用機(jī)器人控制矩陣。它加速了過程，使其自動(dòng)化。
為了證明有效性，他的研究小組從阿爾茨海默病、亨廷頓氏病、側(cè)索硬化癥和帕金森氏癥的全基因組關(guān)聯(lián)研究中借來了一些數(shù)據(jù)，并與新的互作組數(shù)據(jù)相比對(duì)。他們利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)來發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)多個(gè)疾病基因的蛋白和通路。研究小組繼續(xù)引入激酶，以便研究化的變化如何改變網(wǎng)絡(luò)。
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