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環(huán)酰苷放免檢測(cè)操作說(shuō)明書(shū)
CAMP RIA KIT
一、藥物供應(yīng)試驗(yàn)
1.BSA 1瓶（用于配制0.2%BSA的醋酸緩沖液）：溶于 15 毫升50mM PH 4.75
的醋酸緩沖液（配法見(jiàn)后）
2.乙?；瘎┰噭菏褂们皩⑷野泛痛佐靹蚣纯?三乙胺和醋酐各一瓶)
3.125I- CAMP1瓶：使用時(shí)用50 mM醋酸緩沖液 10 毫升稀釋標(biāo)記品（約2萬(wàn)CPM左右/0.1ml）.
4. CAMP標(biāo)準(zhǔn)1瓶：取 100 微升，用 2.6 毫升50 mM醋酸緩沖液稀釋為2pmol/0.1ml，然后倍比稀釋成8個(gè)濃度點(diǎn)：1、0.5、0.25、0.125、0.062、0.031、0.016、0.008pmol/0.1ml
(B1～B8)。
5. CAMP抗血清一瓶：使用時(shí)用含0.2%BSA的醋酸緩沖液13 毫升溶解
6.羊抗兔IgG血清1瓶，每瓶用 10 ml生理鹽水溶解即可，4℃保存。
7.正常兔血清1ml，用 10 ml生理鹽水溶解即可4℃保存。
8、EDTA抗凝劑1瓶。
9、醋酸緩沖液1瓶： 1：4稀釋（1份該液加3份蒸餾水）。
二、操 作
CAMP RIA 加液程序 （單位： ul ）
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試 劑 T NSB B0 S1~S8 樣 品
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醋醋緩沖液 —— 200 100 —— ——
標(biāo) 準(zhǔn) 品 —— —— —— 100 ——
樣 品 —— —— —— —— 100
乙酰化試劑 —— 5 5 5 5
抗 血 清 —— —— 100 100 100
125I-CAMP 100 100 100 100 100
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充分混勻，4℃ 過(guò)夜。
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正常兔血清 100 100 100 100 100
羊抗兔IgG 100 100 100 100 100
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充分混勻，4℃ 過(guò)夜。
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搖勻，室溫放置2～3h, 3000rpm離心15分鐘，吸去上清，在γ計(jì)數(shù)器上測(cè)定沉淀CPM數(shù)。
三、計(jì)算
NSB為非特異結(jié)合管，標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣本測(cè)得值均需減去NSB值，以B/B0計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)及待測(cè)樣品結(jié)合百分率，在半對(duì)數(shù)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并查出樣品值?；蛴?gamma;計(jì)數(shù)器預(yù)先編制得程序，直接給出有關(guān)參數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品濃度。或從EXEL表格中的直線回歸方法計(jì)算。所得結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即可。
四、樣品收集
1、需配試劑
1） EDTA抗凝劑。取9.3克EDTA二鈉鹽加入1mol/L NaOH溶液25ml，溶解后加水到50ml.。
2） 50mMPH4.75醋酸緩沖液，（含4mM EDTA）：取27.22克NaAc . 3H20溶于1000ml蒸餾水，即為0.2M NaAc，用冰醋酸配制0.2M醋酸，然后取410毫升0.2M HAC和590毫升0.2M NaAc混勻，測(cè)PH值調(diào)到PH 4.75，然后每1000毫升溶液加入5.95克 EDTA 二鈉鹽溶解即可.此溶液為200 Mm pH 4.75 的醋酸緩沖液，EDTA為16mM。使用時(shí)將該液1：4稀釋。（1份該液加3份蒸餾水）即成50mM pH4.75醋酸緩沖液，含EDTA 4Mm.
2、血樣本處理
1） 取靜脈血1～2ml，注入含DETA抗凝劑50ul的試管中，搖勻，一小時(shí)內(nèi)離心4℃，2000rpm離心10min，分離血漿， —20℃保存，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
2） 血漿處理：取0.1ml血漿加入2ml無(wú)水乙醇，振搖1分鐘，靜置5分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。將上清液到入指形管或青mei素小瓶，殘?jiān)偌尤?5%乙醇1ml，勻漿，3000rpm離心10分鐘。合并上清液，于60℃烤箱中吹干，殘?jiān)庞?℃保存。測(cè)量時(shí)用1ml醋酸緩沖液溶解，然后取0.1ml測(cè)量，此時(shí)稀釋倍數(shù)為100。結(jié)果×100即為pmol/ml.
3、組織樣品處理
取組織50毫克左右放入盛有2ml冷的50mM PH4.75醋酸緩沖液的試管內(nèi)(冰浴)，勻漿，加入2ml無(wú)水乙醇，混勻，靜止5分鐘，3500轉(zhuǎn)離心15分鐘，將上清液收集在青mei素小瓶?jī)?nèi)，再用75%乙醇2ml洗沉淀，勻漿分散，混勻，3500轉(zhuǎn)離心15分鐘。合并上清液,60℃烤箱中吹干，殘?jiān)庞?℃保存。測(cè)量時(shí)用1ml醋酸緩沖液溶解，然后取0.1ml測(cè)量。
4、對(duì)于血、組織樣本，不同血樣或組織中的CAMP或CGMP含量不同，測(cè)試前預(yù)實(shí)驗(yàn)確定樣品稀釋度。
五、正常人血漿參考值：
CAMP:23.1±7.7pmol/ml
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