顯色基質(zhì)鱟試劑盒操作方法！
用途：
顯色基質(zhì)鱟試劑( Chromogenic End-point TachypleusAmebocyte Lysate ， CE TAL )用于體外細
菌內(nèi)毒素的定量檢測，禁止以任何途徑進入機體。
原理：
鱟試劑為鱟科動物東方鱟的血液變形細胞溶解物的冷凍干燥品，鱟試劑中含有Ｃ因子、Ｂ因子、
凝固酶原、凝固蛋白原等。在適宜的條件下（溫度，pH值及無干擾物質(zhì)），細菌內(nèi)毒素激活C 因子，
引起一系列酶促反應，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的顯色基質(zhì)，使其分解為多
肽和黃色的對硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm） 。在一定時間內(nèi)，pNA的生成量與細菌內(nèi)毒素濃度成正相關(guān)，據(jù)此，可以定量供試品的內(nèi)毒素濃度。
同時，對硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化試劑染成玫瑰紅色（λmax = 545nm），避免了供試品本身
的顏色對405nm處吸收峰的干擾。
檢測限：
按反應時間不同可檢測0.1EU/ml-1 EU/ml 和0.01EU/ml -0.1EU/ml 兩個區(qū)間( 反應時間T 1 和T
2 見出廠檢驗報告) 。
用法：
1. 材料和設(shè)備
1.1 試劑
鱟試劑、細菌內(nèi)毒素工作品、顯色基質(zhì)、偶氮化試劑1 、偶氮化試劑2 、偶氮化試劑3、HC l ( 反
應終止劑) 、細菌內(nèi)毒素檢查用水。
1.2 器材
無熱原試管、無熱原吸頭、旋渦混合儀、移液器、多道移液器、封口膜、試管架、恒溫水浴箱
（37±1℃）、分光光度計。
注意：接觸試劑及供試品的所有器皿必須是無熱原的(我公司提供無熱原耗材)。
玻璃器皿可經(jīng) 250℃干烤至少 60 分鐘去除熱原。
2. 供試品的貯存與預處理
備注：若供試品為血液類，請參照我廠配套血液相關(guān)處理試劑使用說明書。
2.1 供試品的 pH 值應在 6 - 8 之間，若超出此范圍，需用無熱原緩沖液、0.1N *或 0.1N 鹽酸
調(diào)節(jié)。
2.2 若供試品中可能存在鱟實驗的干擾物質(zhì)，處理參見【供試品的干擾試驗】。
2.3 若供試品中可能含有β－葡聚糖（β－葡聚糖會產(chǎn)生 G 因子旁路反應，干擾內(nèi)毒素檢測），需選
用特異性鱟試劑（我公司提供）。
2.4 若供試品為一些抗菌塐如頭孢類抗菌塐和磺胺制劑會對偶氮染色劑產(chǎn)生偶聯(lián)反應而干擾偶氮化
顯色，需要選用不含偶氮化試劑的試劑盒（我公司提供）。
2.5 若供試品的本底吸光度值大于 0.5，必須對供試品進行稀釋后再檢測。
2.6 若供試品顏色較深(例如溶血)，或在酸性條件下顏色加深(例如一些組織培養(yǎng)介質(zhì))，必須設(shè)置供
試品空白管以扣除供試品自身的顏色本底。供試品空白管不加入鱟試劑，以等體積鱟試劑的溶
劑(該處為細菌內(nèi)毒素檢查用水)代替。其余操作同供試品管。
實驗操作
取無熱原試管，加入 100μl 細菌內(nèi)毒素檢查用水、內(nèi)毒素標準溶液，或供試品。再加入 100μl 鱟
試劑溶液，混勻，37ºC 溫育 T1 分鐘。溫育結(jié)束，加入 100μl 顯色基質(zhì)溶液，混勻，37ºC 溫育 T2
分鐘。溫育結(jié)束，加入 500μl 偶氮化試劑 1 溶液，混勻，加入 500μl 偶氮化試劑 2 溶液，混勻加入
500μl 偶氮化試劑 3 溶液，混勻，靜置 5 分鐘，于 545nm 波長處讀取吸光度值。
干擾試驗，步驟如下：
1. 選擇標準曲線中點或一個靠近中點的內(nèi)毒素濃度（設(shè)為λm），作為供試品干擾試驗中添加的內(nèi)毒
素濃度，配制含λm 內(nèi)毒素的供試品陽性對照，測量出該溶液的內(nèi)毒素濃度，稱為 Cs；
2. 測量出未添加外源內(nèi)毒素的供試品溶液內(nèi)毒素濃度，稱為 Ct；
3. 計算該試驗條件下的回收率 R＝（Cs–Ct）/λm×
4. 當 R 在 50%～200%之間，則認為在此試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。
5. 當 R 在 50%～200%之外，需對供試品進行系列稀釋(稀釋倍數(shù)不得超過大有效稀釋倍數(shù) MVD)
或進行其它處理消除干擾，每一稀釋溶液都重復步驟 1-3，直到內(nèi)毒素的回收率 R 在 50%～200%
之間。選擇回收率 R 接近 的稀釋倍數(shù)進行內(nèi)毒素檢測。
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