熟知實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備技術(shù)
一、
培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項(xiàng)
１、培養(yǎng)基配方的選定
同一種培養(yǎng)基的配方在不同著作中常會(huì)有某些差別。因此，除所用的是標(biāo)準(zhǔn)方法，應(yīng)嚴(yán)格按其規(guī)定進(jìn)行配制外，一般均應(yīng)盡量收集有關(guān)資料，加以比較核對(duì)，再依據(jù)自己的使用目的，加以選用，記錄其來(lái)源。
２、培養(yǎng)基的制備記錄
每次制備培養(yǎng)基均應(yīng)有記錄，包括培養(yǎng)基名稱(chēng)，配方及其來(lái)源，和各種成份的牌號(hào)，zui終pH值、消毒的溫度和時(shí)間制備的日期和制備者等，記錄應(yīng)復(fù)制一份，原記錄保存?zhèn)洳?，?fù)制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)生混亂。
３、培養(yǎng)基成分的稱(chēng)取
培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱(chēng)取并要注意防止錯(cuò)亂，zui-好一次完成，不要中斷?？蓪⑴浞街糜诎鴤?cè)，每稱(chēng)完一種成分即在配方面軍做出記號(hào)，并將所需稱(chēng)取的藥品一次取齊，置于左側(cè)，每種稱(chēng)取完畢后，即移放于右側(cè)。*稱(chēng)取完畢后，還應(yīng)進(jìn)行一次檢查。
４、培養(yǎng)基各成份的混合和溶化
培養(yǎng)基所用化學(xué)藥品均應(yīng)是化學(xué)純的。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細(xì)菌不易生長(zhǎng)。zui-好使用不銹鋼鍋加熱溶化，可放入大燒杯或大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流動(dòng)蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在鍋中溶化時(shí)、可先用溫水加熱并隨時(shí)擾動(dòng)、以防焦化、如發(fā)現(xiàn)有焦化現(xiàn)象、該培養(yǎng)基即不能使用，應(yīng)重新制備。待大部分固體成分溶化后，再用較小火力使所有成分*溶化，迄至煮沸。如為瓊脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后將兩溶液充分混合。在加熱溶化過(guò)程中，因蒸發(fā)而丟失的水分，zui'后必須加以補(bǔ)足。
５、培養(yǎng)基pH的初步調(diào)正
因培養(yǎng)基在加熱消毒過(guò)程中、pH會(huì)有所變化，培養(yǎng)基各成分*溶解后，應(yīng)進(jìn)行PH的初步調(diào)正。例如，牛肉浸液約可降低pH0.2，而腸浸液pH卻會(huì)有顯著的升高。因此，對(duì)這個(gè)步驟，操作者應(yīng)隨時(shí)注意探索經(jīng)驗(yàn)、以期能掌握培養(yǎng)基的zui終PH，保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。PH調(diào)整后，還應(yīng)將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘，以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。
６、培養(yǎng)基的過(guò)濾澄清
液體培養(yǎng)基必須澄清，瓊脂培養(yǎng)基也應(yīng)透明無(wú)顯著沉淀，因此，須要采用過(guò)濾或其它澄清方法以達(dá)到此項(xiàng)要求。一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過(guò)濾法，濾紙應(yīng)折疊成折扇或漏斗形，以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂。
瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過(guò)濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過(guò)濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時(shí)、則須先用絨布將碎渣濾去，再用濾紙反復(fù)過(guò)濾。如過(guò)濾法不能達(dá)到澄清要求、則須用蛋清澄清法。即將冷卻至55~60°C的培養(yǎng)基放入大的三角燒瓶?jī)?nèi)，裝入量不得超過(guò)燒瓶容量的1/2，每1000ml培養(yǎng)基加入1~2個(gè)雞蛋的蛋白，強(qiáng)力振搖3~5分鐘，置高壓蒸汽滅菌器中、121°C加熱20分鐘、取出趁熱以絨布過(guò)濾即可。
７、培養(yǎng)基的分裝
培養(yǎng)基的分裝，應(yīng)按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當(dāng)容器內(nèi)。分裝量不得超過(guò)容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，其外還須用防水紙包扎（現(xiàn)試管一般多有用螺旋蓋者）。分裝時(shí)zui-好能使用半自動(dòng)或電動(dòng)的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養(yǎng)基時(shí)，分裝量應(yīng)以能形成2/3底層和1/3斜面的量為洽當(dāng)。分裝容器應(yīng)預(yù)先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒，以利于培養(yǎng)基的*滅菌。每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝20ml培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時(shí)滅菌，以為測(cè)定該批培養(yǎng)基zui終pH之用。
８、培養(yǎng)基的滅菌
一般培養(yǎng)基可采用121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如無(wú)特殊規(guī)定，即可用此法滅菌。
某些畏熱成分，如糖類(lèi)，應(yīng)另行配成20%或更高的濃液，以過(guò)濾或間歇滅菌法消毒，以后再用無(wú)菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基。明膠培養(yǎng)基亦應(yīng)用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應(yīng)以無(wú)菌操作技術(shù)抽取和加入于經(jīng)冷卻約50°C左右的培養(yǎng)基中。
瓊脂斜面培養(yǎng)基應(yīng)在滅菌后立即取出，冷至55℃-60℃時(shí)，擺置成適當(dāng)斜面，待其自然凝固。
９、培養(yǎng)基的質(zhì)量測(cè)試
每批培養(yǎng)基制備好以后，應(yīng)仔細(xì)檢查一遍，如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應(yīng)挑出棄去。并測(cè)定其zui終pH。
將全部培養(yǎng)基放入36±1°C恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長(zhǎng)，即棄去。
用有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種1~2管或瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)24~48小時(shí)，如無(wú)菌生長(zhǎng)或生長(zhǎng)不好。應(yīng)追查原因并重復(fù)接種一次，如結(jié)果仍同前，則該批培養(yǎng)基即應(yīng)棄去，不能使用。
10、培養(yǎng)基的保存
培養(yǎng)基應(yīng)存放于冷暗處，zui-好能放于普通冰箱內(nèi)。放置時(shí)間不宜超過(guò)一周，傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過(guò)3天。每批培養(yǎng)基均必須附有該批培養(yǎng)基制備記錄副頁(yè)或明顯標(biāo)簽。
二、培養(yǎng)基的類(lèi)型
在實(shí)驗(yàn)室中配制的適合微生物生長(zhǎng)繁殖或累積代謝產(chǎn)物的任何營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，都叫做培養(yǎng)基(Media)。由于各類(lèi)微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不同，培養(yǎng)目的和檢測(cè)需要不同，因而培養(yǎng)基的種類(lèi)很多。我們可根據(jù)某種標(biāo)準(zhǔn)，將種類(lèi)繁多的培養(yǎng)基劃分為若干類(lèi)型。
1、根據(jù)對(duì)培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)成分是否*了解來(lái)區(qū)分，可以將培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基。
１）天然培養(yǎng)基 天然培養(yǎng)基是指利用各種動(dòng)、植物或微生物的原料，其成分難以確切知道。用作這種培養(yǎng)基的主要原料有：牛肉-膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等。用這些物質(zhì)配成的培養(yǎng)基雖然不能確切知道它的化學(xué)成分，但一般來(lái)講，營(yíng)養(yǎng)是比較豐富的，微生物生長(zhǎng)旺盛，而且來(lái)源廣泛，配制方便，所以較為常用，尤其適合于配制實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的穩(wěn)定性常受生物試劑廠(chǎng)或批號(hào)等因素的影響。
２）合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是一類(lèi)化學(xué)成分和數(shù)量*知道的培養(yǎng)基，它是用已知化學(xué)成分的化學(xué)藥品配制而成。這類(lèi)培養(yǎng)基化學(xué)成分精確、重復(fù)性強(qiáng)，但價(jià)格昂貴，而微生物又生長(zhǎng)緩慢，所以它只適用于做一些科學(xué)研究，例如營(yíng)養(yǎng)、代謝的研究。
３）半合成培養(yǎng)基 在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學(xué)藥品即成半合成培養(yǎng)基。例如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。這種培養(yǎng)基在生物試劑實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)室中使用zui多。
２、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來(lái)區(qū)分，可以分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。
１）液體培養(yǎng)基 所配制的培養(yǎng)基是液態(tài)的，其中的成分基本上溶于水，沒(méi)有明顯的固形物，液體培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分分布均勻，易于控制微生物的生長(zhǎng)代謝狀態(tài)。
２）固體培養(yǎng)基 在液體培養(yǎng)基中加入適量的凝固劑即成固體培養(yǎng)基。常用作凝固劑的物質(zhì)有瓊脂、明膠、硅膠等，以瓊脂zui為常用。固體培養(yǎng)基在實(shí)際中用得十分廣泛。在實(shí)驗(yàn)室中，它被用作微生物的分離、鑒定、檢驗(yàn)雜菌、計(jì)數(shù)、保藏、生物測(cè)定等。
３）半固體培養(yǎng)基 如果把少量的凝固劑加入到液體培養(yǎng)基中，就制成了半固體培養(yǎng)基。以瓊脂為例，它的用量在0.2~1%之間。這種培養(yǎng)基有時(shí)可用來(lái)觀(guān)察微生物的動(dòng)力，有時(shí)用來(lái)保藏菌種。
３、根據(jù)培養(yǎng)基的用途來(lái)區(qū)分，可分為選擇培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基等。
１）選擇培養(yǎng)基 在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)以殺死或抑制不需要的菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，稱(chēng)之為選擇培養(yǎng)基。如鏈mei素、氯mei素等抑制原核微生物的生長(zhǎng)；而制霉菌塐、灰黃mei素等能抑制真核微生物的生長(zhǎng)；結(jié)晶紫能抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的生長(zhǎng)等。
２）增殖培養(yǎng)基 在自然界中，不同種的微生物常生活在一起，為了分離我們所需要的微生物，在普通培養(yǎng)基中加入一些某種微生物特別喜歡的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以增加這種微生物的繁殖速度，逐漸淘汰其它微生物，這種培養(yǎng)基稱(chēng)為增殖培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基常用于菌種篩選和選擇增菌中。在某種程度上講，增殖培養(yǎng)基也是一種選擇培養(yǎng)基。
３）鑒別培養(yǎng)基 在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使難以區(qū)分的微生物經(jīng)培養(yǎng)后呈現(xiàn)出明顯差別，因而有助開(kāi)快速鑒別某種微生物。這樣的培養(yǎng)基稱(chēng)之為鑒別培養(yǎng)基。例如用以檢查飲水和乳品中是否含有腸道致病菌的伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基就是一種常用的鑒別性培養(yǎng)基。
有些培養(yǎng)基是具有選擇和鑒別雙重作用。例如食品檢驗(yàn)中常用的麥康凱培養(yǎng)基是一例。它含有膽鹽、乳糖和中性紅。膽鹽具有抑制腸道菌以外的細(xì)菌的作用（選擇性），乳糖和中性紅（指示劑）能幫助區(qū)別乳糖發(fā)酵腸道菌（如大腸桿菌）和不能發(fā)酵乳糖的腸道致病菌（如沙門(mén)氏菌和志賀氏菌）。
另外，根據(jù)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分是否“*”，可以分為基本培養(yǎng)基、*培養(yǎng)基和補(bǔ)充培養(yǎng)基，這類(lèi)術(shù)語(yǔ)主要是用在微生物遺傳學(xué)中。根據(jù)培養(yǎng)基用于生物試劑的目的來(lái)區(qū)分，可以分為種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。還有專(zhuān)門(mén)用于培養(yǎng)病毒等寄生微生物的活組織培養(yǎng)基，如雞胚等；專(zhuān)門(mén)用于培養(yǎng)自養(yǎng)微生物的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基等。
三、 玻璃器皿的清洗
在制備培養(yǎng)基的過(guò)程中，首先要使用一些玻璃器皿，如試管、三角瓶、培養(yǎng)皿、燒杯和吸管等。這些器皿在使用前都要根據(jù)不同的情況，經(jīng)過(guò)一定的處理，洗刷干凈。有的還要進(jìn)行包裝，經(jīng)過(guò)滅菌等準(zhǔn)備就緒后，才能使用。
1、新購(gòu)的玻璃器皿
除去包裝沾染的污垢后，先用熱肥皂水刷洗，流水沖凈，再浸泡于１～２％的工業(yè)鹽酸中數(shù)小時(shí)，使游離的堿性物質(zhì)除去，再以流水沖凈。對(duì)容量較大的器皿，如大燒瓶、量筒等，洗凈后注入濃鹽酸少許，轉(zhuǎn)動(dòng)容器使其內(nèi)部表面均沾有鹽酸，數(shù)分鐘后傾去鹽酸，再以流水沖凈，倒置于洗滌架上將水空干，即可使用。
2、用過(guò)的玻璃器皿
凡確無(wú)病原菌或未被帶菌物污染的器皿，使用后可隨時(shí)沖洗，吸取過(guò)化學(xué)試劑的吸管，可先浸泡于清水中，待到一定數(shù)量后再集中進(jìn)行清洗。有可能被病原菌污染的器皿，必須經(jīng)過(guò)適當(dāng)消毒后，將污垢除去，用皂液洗刷，再用流水沖洗干凈。若用皂液未能洗凈的器皿，可用洗液浸泡適當(dāng)時(shí)間后再用清水洗凈。洗液的主要成份是重鉻酸鉀和濃流酸，其作用是將有機(jī)物氧化成可溶性物質(zhì)，以便沖洗。洗液有很強(qiáng)的腐蝕作用，使用時(shí)應(yīng)特別小心，避免濺到衣服、身體和其他物品上。
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