RT－PCR 已經(jīng)成為研究者確定感興趣的器官、組織或細(xì)胞中mRNA 轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)、結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平的基本方法。RT－PCR的基本步驟包括：首先對(duì)樣品中出現(xiàn)的所有mRNA 合成一個(gè)cDNA拷貝，接著擴(kuò)增感興趣的基因。因?yàn)閮蓚€(gè)步驟中使用的反應(yīng)緩沖液不能兼容，所以這兩個(gè)步驟（RT 和PCR）通常分別進(jìn)行。即使有些試劑盒能將兩個(gè)步驟合而為一，但是同樣因?yàn)樯鲜龅木彌_液不兼容性，地限制了檢測(cè)靈敏度。Eppendorf 設(shè)計(jì)了一個(gè)含有全新化學(xué)物質(zhì)的新試劑盒，使一步法RT－PCR 更加有效，在兩步法實(shí)驗(yàn)中可以獲得更高的靈敏度。
簡(jiǎn)介
逆轉(zhuǎn)錄（RT）以及隨后進(jìn)行的PCR（RT－PCR）是RNA 分析中使用得zui廣泛的技術(shù)之一。如果需要平行分析多個(gè)RNA 樣品，方法為一步法RT－PCR。如果要擴(kuò)增困難目標(biāo)片段或從單一cDNA 池中擴(kuò)增多重目標(biāo)片段則會(huì)選擇兩步法。Eppendorf 推出的全新的cMaster RTplusPCR 系統(tǒng)適用于各種RT－PCR 應(yīng)用。它含有一種全新的重組逆轉(zhuǎn)錄酶和一種具有高保真性的PCR 酶混合物。另外，RTplusPCR反應(yīng)緩沖液能夠自動(dòng)調(diào)節(jié)鎂離子濃度，因此這一重要成分的濃度無(wú)需優(yōu)化。這種自我調(diào)節(jié)的效果是通過(guò)對(duì)鎂離子的弱螯合作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。如果鎂離子濃度過(guò)高，螯合劑會(huì)與過(guò)剩的鎂離子結(jié)合，如果反應(yīng)（Taq 或DNA）需要鎂離子，鎂離子就會(huì)被釋放出來(lái)。這種創(chuàng)新技術(shù)提高了cMaster RTplusPCR的靈敏度和特異性。使cMaster RTplusPCR試劑盒既能進(jìn)行一步法，又能進(jìn)行兩步法RT－PCR，而且具有很大的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)范圍，能擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度范圍也很大（一步法反應(yīng)zui長(zhǎng)可擴(kuò)增5.3 kb片段；兩步法方案zui長(zhǎng)能擴(kuò)增12.3 kb 片段）。
下面的實(shí)驗(yàn)可以展示該試劑盒在不同應(yīng)用中的表現(xiàn)。
實(shí)驗(yàn)1關(guān)注新試劑盒在一步法RT－PCR 中的靈敏度。而在一步法應(yīng)用中，zui重要的因素就是能夠采用盡可能少的目標(biāo)材料進(jìn)行有效工作。
實(shí)驗(yàn)2顯示應(yīng)用一步法方案進(jìn)行長(zhǎng)距離RT－PCR 不再是個(gè)難題。試劑盒中創(chuàng)新的緩沖液能同時(shí)保證逆轉(zhuǎn)錄酶和高保真酶混合物都具有延伸性。
本系統(tǒng)提供的兩步法RT－PCR 備選程序適用的模板范圍很廣。實(shí)驗(yàn)3描述了對(duì)不同模板的擴(kuò)增情況。這個(gè)新的系統(tǒng)能為所有的RT目標(biāo)提供全面解決方案，不論需要擴(kuò)增的片段是中等長(zhǎng)度還是極長(zhǎng)，不同來(lái)源的總RNA 中轉(zhuǎn)錄本是低豐度還是高豐度。
材料和方法
Eppendorf cMaster RTplusPCR系統(tǒng)
Eppendorf Perfect RNA Eukaryotic試劑盒
所有的PCR反應(yīng)均在Eppendorf Mastercycler® gradient梯度PCR儀上進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)1：一步法靈敏度檢測(cè)RT－PCR
擴(kuò)增目標(biāo)：500 bp 的人α微管蛋白mRNA。
模板RNA：從人HELA細(xì)胞中純化的總RNA。反應(yīng)中應(yīng)用的模板濃度從1μg遞減至10pg。
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR系統(tǒng)，標(biāo)準(zhǔn)一步法RT－PCR方案。1:10 稀釋RTplusPCR 緩沖液，鎂離子終濃度2.5 mM，反應(yīng)總體積50μl
循環(huán)參數(shù)：
| 循環(huán) | 步驟 | 溫度 | 時(shí)間 | 描述 |
| 1x | 1 | 50°C | 30分鐘 | 逆轉(zhuǎn)錄 |
| 1x | 2 | 94°C | 3分鐘 | 初始變性 |
| 40x { | 3 | 94°C | 15秒 | 模版變性 |
| 4 | 68°C | 45秒 | 引物退火/延伸 |
結(jié)果
 | cMaster RTplusPCR 系統(tǒng)顯示出一種依賴(lài)于模板RNA 量的寬廣的產(chǎn)物產(chǎn)量動(dòng)力學(xué)范圍。能從低至10 pg 的HELA 總RNA中檢測(cè)到α微管蛋白mRNA。 |
實(shí)驗(yàn)2：一步法擴(kuò)增長(zhǎng)片段RT－PCR
擴(kuò)增目標(biāo)：5.3 kb 的人結(jié)節(jié)性腦硬化因子（hTSF）mRNA&片段。
模板RNA：從人HELA 細(xì)胞中純化的總RNA。反應(yīng)中應(yīng)用的模板濃度為100ng和10ng。
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 試劑盒，針對(duì)長(zhǎng)模板的特殊RT－PCR 方案。
設(shè)置一步法RT－PCR 反應(yīng)。
| 成分 | 50μl RT－PCR反應(yīng)體積 | 反應(yīng)成分的終濃度 |
| 不含RNA 酶的水 | 2.5μl | |
| dNTP 混合物 每種dNTP 濃度均為10 mM | 2.5μl | 500μM |
| hTSF正向引物 | 1.0μl | 200 nM |
| hTSF反向引物 | 1.0μl | 200 nM |
| 總HELA RNA | 3.0μl | 每個(gè)反應(yīng)中中含10ng－100ng |
| MasterMix 1 | 10.0μl | |
| 不含RNA 酶的水 | 34.0μl | |
| 含鎂離子的RTplusPCR 反應(yīng)緩沖液 | 5.0μl | 1×；2.5 mM 鎂離子 |
| cMaster RT 酶 | 0.5μl | 0.15U /μl |
| cMaster PCR 酶混合物 | 0.5μl | 0.05U /μl |
| MasterMix 2 | 40.0μl |
循環(huán)程序參數(shù)
| 循環(huán) | 步驟 | 溫度 | 時(shí)間 | 描述 |
| 1x | 1 | 65°C | 5分鐘 | 初始RNA變性 |
| 1x | 2 | 42°C | 60分鐘 | 逆轉(zhuǎn)錄 |
| 1x | 3 | 93°C | 3分鐘 | 初始變性 |
| 35x { | 4 | 94°C | 15秒 | 模版變性 |
| 5 | 59°C | 30秒 | 引物退火 | |
| 6 | 68°C | 5.5分鐘 | 引物退火 |
結(jié)果
 | 如圖2 所示，應(yīng)用一步法RT－PCR 方法，可以從100 ng 和10 ng 總RNA 中檢測(cè)到5.3 kb 的hTSF PCR 產(chǎn)物。這個(gè)PCR 反應(yīng)非常困難，大多數(shù)RT－PCR 試劑盒生物試劑廠家從未發(fā)布過(guò)應(yīng)用一步法方案，有效擴(kuò)增類(lèi)似長(zhǎng)度模板的結(jié)果。相反，Eppendorf 試劑盒能穩(wěn)定可靠地從10 ng HELA 細(xì)胞RNA 中擴(kuò)增該產(chǎn)物。 |
實(shí)驗(yàn)3：兩步法RT－PCR
兩步法RT－PCR 的擴(kuò)增目標(biāo)：
500 bp 的（鼠和人）α微管蛋白mRNA pian段
1.3kb 的（鼠和人）腫瘤壞死因子受體（TNFR1）mRNA pian段
5.3 kb 的人結(jié)節(jié)性腦硬化因子（hTSF）mRNA pian段
12.3 kb 的鼠動(dòng)力蛋白mRNA pian段
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 試劑盒，采用產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中的針對(duì)普通長(zhǎng)度模板和較長(zhǎng)模板的兩步法RT－PCR 程序。所有的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)均采用0.5μg 的Oligo（dT）20 引物為引物。
設(shè)置*步RT 反應(yīng)
| 成分 | 以O(shè)ligo（dT）20 為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 | 反應(yīng)成分的終濃度 |
| 不含RNA 酶的水 | 加至MasterMix 1 總體積為10μl | |
| dNTP 混合物 每種dNTP 濃度均為10 mM | 1.0μl | 1mM |
| Oligo（dT）20 引物（0.5μg /μl） | 1.0μl | 25ng/μl |
| 模版RNA | ||
| HELA (350ng/μl) | 3.0μl | } 1μg總RNA |
| A細(xì)胞(1 μg/μl) | 1.0μl | |
| L細(xì)胞(220ng/μl) | 4.5μl | |
| McCoy細(xì)胞(135ng/μl) | 7.0μl | |
| MasterMix 1 | 10.0μl | |
| 不含RNA 酶的水 | 5.0μl | |
| 含鎂離子的RTplusPCR 反應(yīng)緩沖液 | 4.0μl | 2×；5 mM 鎂離子 |
| RTplusPCR 反應(yīng)緩沖液 | ||
| cMaster RT 酶 | 1μl | 0.75U /μl |
| MasterMix 2 | 10.0μl |
設(shè)置第二步PCR 反應(yīng)
| 成分 | 普通PCR（微管蛋白TNFR1） | 長(zhǎng)片段（動(dòng)力蛋白，hTSF） | 反應(yīng)成分終濃度 |
| 不含RNA 酶的水 | 7.0μl | 6.0μl | |
| 正向引物 | 1.0μl | 1.0μl | 0.2μM |
| 反向引物 | 1.0μl | 1.0μl | 0.2μM |
| *步逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物 | 1.0μl | 2.0μl | N / A |
| MasterMix 3 | 10.0μl | 10.0μl | |
| 不含RNA 酶的水 | 33.6μl | 32.0μl | |
| 含25 mM 鎂離子的RTplusPCR反應(yīng)緩沖液 | 5.0μl | - | 1×；2.5 mM 鎂離子 |
| 含25 mM 鎂離子的 10×Tuning 反應(yīng)緩沖液 | － | 5.0μl | 1×；2.5 mM 鎂離子 |
| dNTP 混合物/ 每種dNTP 濃度均為10 mM | 1.0μl | 2.5μl | 200μM（500μM） |
| cMaster PCR 酶混合物 | 0.4μl（2U） | 0.5μl（2.5U） | 0.04－0.05 U /μl |
| MasterMix 4 | 40.0μl | 40.0μl |
RT反應(yīng)條件
| 步驟 | 溫度 | 時(shí)間 | 描述 |
| 1 | 65°C | 5分鐘 | 初始模版變性 |
| 2 | 0°C | 5分鐘 | 冷卻變性模版 |
| 3 | 42°C | 60分鐘 | *鏈cDNA合成 |
| 4 | -20°C | 直到PCR | 引物退火/延伸 |
注：動(dòng)力蛋白的逆轉(zhuǎn)錄孵育時(shí)間延長(zhǎng)至90 分鐘。
| 循環(huán) | 步驟 | 溫度 | 時(shí)間 | 描述 |
| 1x | 1 | 94°C | 3分鐘 | 初始變性 |
| 35x { | 2 | 94°C | 15秒 | 模版變性 |
| 3 | 68°C | 40s/60s | 引物退火/延伸 |
* —— 微管蛋白
** —— TNFR1
hTSF 和動(dòng)力蛋白的三步循環(huán)方案
| 循環(huán) | 步驟 | 溫度 | 時(shí)間 | 描述 |
| 1x | 1 | 93°C | 3分鐘 | 初始模版變性 |
| 35x { | 2 | 93°C | 15秒 | 模版變性 |
| 3 | 56°C | 30秒 | 引物退火 | |
| 4 | 68°C | 12分鐘 | 引物延伸 |
不同大小目的片段所采用的延伸時(shí)間和退火溫度
| 目的片段 | 微管蛋白 | TNFR1 | hTSF | 動(dòng)力蛋白 |
| 延伸時(shí)間（PCR） | 40秒 | 1分鐘 | 5.5 分鐘 | 12 分鐘 |
| 退火溫度 | 68℃ | 68℃ | 59℃ | 56℃ |
| 退火時(shí)間 | — | — | 30 秒 | 30 秒 |
| 每循環(huán)增加時(shí)間 | — | — | — | 20 秒 |
結(jié)果
 | 對(duì)5 種不同表達(dá)水平的基因進(jìn)行RT－PCR。為了得到zui高的靈敏度，RT 和PCR 反應(yīng)分開(kāi)進(jìn)行。如圖3 所示，對(duì)于α微管蛋白和TNFR1，我們可以應(yīng)用兩步法RT－PCR 方法并將退火和延伸步驟合并為進(jìn)行一次68℃ 孵育。如圖3 所示，無(wú)論片段長(zhǎng)度大小和拷貝數(shù)高低，所有反應(yīng)都可以順利進(jìn)行。即使對(duì)于動(dòng)力蛋白這種特別長(zhǎng)（達(dá)12.3 kb）的稀有轉(zhuǎn)錄本，用cMaster RTplusPCR 系統(tǒng)也能夠進(jìn)行有效擴(kuò)增，而且結(jié)果具有的重復(fù)性，表明即使對(duì)于困難的RT－PCR 反應(yīng)， Eppendorf 試劑盒也能獲得可靠結(jié)果。
|
cMaster RT 系統(tǒng)是為了給所有的RT 和RT－PCR 應(yīng)用提供zui大的靈活性而設(shè)計(jì)的。該試劑盒結(jié)合了重組的同二聚體病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和*的RTplusPCR 反應(yīng)緩沖液系統(tǒng)，可以在較寬的溫度范圍（37℃－60℃）和0.2kb-12.5kb產(chǎn)物大小范圍內(nèi)進(jìn)行有效的cDNA 合成。cMaster RTplusPCR 酶混合物兼具熱穩(wěn)定性DNA 聚合酶活性，校正功能輔助的保真性和高延伸效率。應(yīng)用于一步法中，可以靈敏地檢測(cè)到極少量的總RNA 并擴(kuò)增出長(zhǎng)達(dá)5.3 kb的cDNA（參見(jiàn)圖1 和圖2） 兩步法方案可以從RT 反應(yīng)中擴(kuò)增多個(gè)目的cDNA，PCR產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度可增加至12.3 kb（參見(jiàn)圖3） 其他的擴(kuò)展應(yīng)用：系統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄部分即cMaster RT 可以與任何PCR系統(tǒng)合用或者為其他下游應(yīng)用如雜交實(shí)驗(yàn)合成cDNA 探針。
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